James Batcheller Sumner (1887-1955) premio Nobel de Química por aislar y cristalizar por primera vez una enzima, la ureasa, demostrando además la naturaleza proteica de las enzimas

         A finales del siglo XIX quedó demostrado que los procesos bioquímicos no requerían necesariamente de la presencia de células vivas, sino que eran producidos por unas sustancias especiales formadas en las células que recibieron la denominación de enzimas. Fue Eduard Büchner quien en 1897 comprobó que la fermentación alcohólica de los azúcares se producía usando solamente un extracto de levadura Saccharomyces libre de células vivas y, por tanto, dedujo que en este extracto existía la sustancia catalizadora y que hoy sabemos es una mezcla compleja de enzimas llamadas zimasas. Por este descubrimiento de gran transcendencia se le concedió el premio Nobel de Química en 1907.

  También se demostró que, además de la fermentación, otros procesos biológicos como la combustión y la respiración celular, el metabolismo de las proteínas, lípidos y carbohidratos, y otras muchas reacciones bioquímicas que se producen en la célula viva podían ser reproducidas en un tubo de ensayo sin la intervención de las células. Pero esto sólo era posible si se añadían extractos celulares a la solución en el tubo de ensayo. Estos principios activos desconocidos, llamados enzimas o fermentos, se convirtieron en uno de los principales problemas de investigación durante las primeras décadas del pasado siglo para conocer su composición y sus efectos. El desafío consistía en poder encontrar métodos para el aislamiento de las formas puras de estas enzimas y determinar su composición química. Se suponía que eran sustancias con una estructura química compleja y con una presencia cuantitativa mínima en las células.

               Por eso resultó muy relevante que James B. Sumner consiguiera en 1926 aislar y cristalizar con éxito una enzima por primera vez, la ureasa. Con este hallazgo, Sumner pudo contradecir a la mayoría de los bioquímicos de su tiempo que creían imposible cristalizar las enzimas. Pero además pudo demostrar que las enzimas eran en realidad proteínas cuando se creía que pertenecían a una categoría aún desconocida de compuestos químicos. El trabajo innovador de Sumner abrió el camino para seguir investigando la estructura y efectos de las enzimas puras lo que derivó en sucesivos descubrimientos sobre el conocimiento de los procesos biológicos que suceden en los organismos vivos.

            Hoy sabemos que la mayoría de las enzimas son proteínas globulares con variable número de cadenas de aminoácidos que son producidas por las células para catalizar reacciones químicas a mayor velocidad y cuando no podrían producirse a la temperatura corporal por lo que son imprescindibles para la vida celular. Cada organismo tiene sus enzimas propias y cada enzima tiene una diferente función. Al día de hoy se han identificado más de 3000 enzimas diferentes, pero se cree que existen muchas más pendientes de identificar.

Biografía de James B. Sumner

      James Batcheller Sumner (1887-1955) nació en Canton (Massachusetts, EEUU), una localidad muy próxima a Boston, en el seno de una familia acomodada que se dedicaba a la producción de textiles de algodón. Desde los primeros años en la escuela sentía predilección por las materias de física y química. A los 17 años, mientras se encontraba de caza, un disparo accidental sobre el antebrazo izquierdo le provocó una herida que precisó la amputación del antebrazo. Esta limitación física no le impidió hacer todo tipo de actividades, incluso la práctica de varios deportes.

James B. Sumner (1887-1955). Bioquímico norteamericano que consiguió en 1926 aislar y cristalizar con éxito una enzima por primera vez, la ureasa, demostrando su naturaleza proteica

           En 1906 Sumner ingresó a la Universidad de Harvard (Cambridge, MA, EEUU) consiguiendo la graduación en Química en 1910. En Harvard coincidió con notables químicos como Roger Adams, Farrington Daniels, Frank C. Whitmore, James Bryant Conant o Charles Loring Jackson. Después de breves pasos como docente en la Universidad de Mount Allison en Sackville (New Brunswick, Canadá) y en el Instituto Politécnico de Worcester (Worcester, MA, EEUU) decidió ir a la Escuela de Medicina de Harvard en 1912 para hacer los estudios de doctorado bajo la dirección del profesor de Bioquímica Otto Folin obteniendo el grado de doctor en 1914 con la tesis “La formación de urea en el organismo animal”. Este mismo año es nombrado profesor asistente de Bioquímica en la Escuela de Medicina de Cornell (Ithaca, NY) ascendiendo a profesor titular en el año 1929. Sumner fue pionero de la Bioquímica en la Universidad de Cornell y seguiría desempeñando la función de liderazgo en esta materia hasta su jubilación en 1955.

         En Cornell comenzó su tarea investigadora centrándose primero en los métodos analíticos pero, a pesar de su tenacidad, no consiguió resultados satisfactorios. Es entonces cuando decide en 1917 dirigir la investigación para aislar una enzima en forma pura, algo que nunca se había logrado. Consideró las posibilidades de este estudio teniendo en cuenta las limitaciones que tenía por la falta de tiempo para investigar por la carga docente, contar con un laboratorio dotado de escaso material y aparataje, falta de financiación y reducido personal asistente.

Planta de la judía variedad jack (Canavalia ensiformis). Fue la elegida por JB Sumner para realizar sus investigaciones pues se suponía era muy rica en la enzima ureasa. (A) Vainas. (B) Semillas

              

       Para el estudio eligió la planta de la judía variedad jack (Canavalia ensiformis) que se suponía era muy rica en una enzima, la ureasa, que cataliza el desdoblamiento de la urea en amoníaco y óxido de carbono. Después de varios años de investigaciones no había conseguido ningún avance, pero no desistía en su empeño a pesar que sus colegas le aconsejaban abandonar por considerarlo un objetivo inalcanzable. En 1921 fue becado para trabajar en la Universidad de Bruselas con el bioquímico Jean Effront que también consideraba el proyecto de Sumner como una investigación baldía. De vuelta a Ithaca reanudó sus estudios hasta que finalmente en 1926 consiguió el aislamiento y cristalización de la ureasa en forma pura y además pudo demostrar mediante pruebas analíticas que era una globulina de naturaleza proteica. Esos resultados fueron publicados ese mismo año en el Journal of Biological Chemestry (J. Biol. Chem., 1926, 69:435-441).

            Para precipitar la ureasa desde el pulverizado de la alubia, Sumner utilizó inicialmente alcohol al 35% pero en 1926 decidió cambiar a acetona al 31.6% para lograr una purificación aún mayor. Después de filtrar y centrifugar la disolución en frío (2.0-2.5ºC) observó al microscopio que se habían formado muchos cristales de pequeño tamaño. Estos cristales tenían una alta actividad ureasa que era unas 700 veces mayor que el pulverizado de las alubias. También comprobó que era posible disolver fácilmente los cristales con agua destilada y volver a conseguir la cristalización varias veces sin que se viera afectada su actividad. Sumner presentó amplia evidencia experimental de que el material cristalino era la enzima ureasa, incluida la observación de que las preparaciones más activas de ureasa que se habían preparado con anterioridad tenían una actividad específica de 30.000 unidades/g de enzima mientras que los cristales disueltos tenían una actividad específica de 100.000 unidades/g.

(A) Cristales octaédricos de ureasa (MO x728 diámetros) según imagen original obtenida en la investigación de JB Sumner. (B) Primera publicación de Sumner anunciando el aislamiento de la ureasa en 1926 (The isolation and crystallization of the enzyme urease: Preliminary paper. J. Biol. Chem. 1926; 69:435-41)

             La respuesta que se produjo por parte de la comunidad científica por este descubrimiento fue de total rechazo e incredulidad. Especialmente dura fue la oposición de Richard Willstätter, químico alemán de gran autoridad y ganador del Premio Nobel de Química en 1915 por sus estudios en el campo de los pigmentos vegetales, que había intentado sin éxito aislar una enzima pura desechando que éstas pudieran ser proteínas, y consideraba que los cristales formados en los estudios de Sumner eran del portador de la enzima y no la enzima pura.

         Sumner publicó diez nuevos artículos ofreciendo datos adicionales que reforzaban la evidencia de que la globulina que había cristalizado era la enzima ureasa. Además, demuestra que la proteólisis de la ureasa, mediatizada por las enzimas proteolíticas papaína y pepsina, da como resultado la pérdida de la actividad enzimática confirmando su naturaleza proteica. Los reconocimientos a su investigación fueron llegando paulatinamente y el respaldo definitivo se produjo cuando en 1930 John H. Northrop, del Instituto Rockefeller de Nueva York, consiguió la cristalización de la pepsina y posteriormente de la tripsina y quimiotripsina, todas ellas enzimas de composición proteica, siguiendo la metodología propuesta por Sumner por lo que quedó definitivamente establecido que Sumner había conseguido un método generalizado para la cristalización de las enzimas. Como reconocimiento a este estudio le fue concedido en 1946 el Premio Nobel de Química junto a John H. Northrop y Wendell M. Stanley, éste último por conseguir la cristalización por primera vez de un virus (TMV) demostrando que era un agregado de moléculas de proteína y ácido nucleico.

        Sumner siguió con su trabajo de investigación sobre enzimas. En 1937 también consiguió la cristalización de una segunda enzima en forma pura, la catalasa, la enzima que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua ejerciendo un papel protector para las células. En ese mismo año de 1937 consiguió una beca Guggenhaim desplazándose a la ciudad sueca de Uppsala para trabajar en el laboratorio del premio Nobel Theodor Svedberg, químico que había desarrollado la ultracentrifugación analítica. Ese mismo año recibe en Estocolmo la Medalla de Oro Scheele por sus contribuciones al estudio de las enzimas. En 1947 es nombrado director del recién creado Laboratorio de Química Enzimática en la Escuela de Agricultura de la Universidad de Cornell como reconocimiento a su larga y destacada trayectoria científica.

             Su actividad científica fue muy densa publicando más de 125 artículos en revistas de prestigio y editó varios manuales que tuvieron gran influencia en el ámbito docente y de investigación como Textbook of Biological Chemistry en 1927 y, en colaboración con George. F. Somers, Chemistry and Methods of Enzymes en 1943 y Laboratory Experiments in Biological Chemistry en 1944. En 1951-2 editó junto a Karl Myrbäck una extensa obra de cuatro volúmenes titulada The Enzymes, Chemistry and Mechanism of Action que contaba con la colaboración de setenta y ocho científicos. Como reconocimientos honoríficos cabe también destacar su admisión como miembro electo en la Academia Nacional de Ciencias de Norteamérica en 1948 y la Asociación Americana de Artes y Ciencias en 1949.

Manual Chemistry and Methods of Enzymes editado por JB Summer y GF Somers (3 Ed, 1953)

      Cuando estaba implicado en la organización de un programa de investigación sobre enzimas en la Universidad de Minas Gerais (Belo Horizonte, Brasil) fue diagnosticado de un cáncer por lo que tuvo que abandonar este proyecto. Entre los días 25 y 26 de mayo de 1955, la Universidad de Cornell organizó un simposio en honor de Sumner con motivo de su jubilación. En ese momento ya se encontraba gravemente enfermo, pero aun así preparó un breve discurso que cautivó a los asistentes. Al día siguiente fue trasladado al hospital especializado en cáncer Roswell Park Memorial Institute en Buffalo (NY, EEUU) falleciendo durante su hospitalización unas semanas más tarde. Sus restos están depositados en el cementerio Canton Corner de su ciudad natal.

Ureasa. Composición, estructura y efectos biológicos

     La ureasa es una metaloenzima, perteneciente al grupo de las amidohidrolasas, que cataliza la hidrólisis de urea a amoníaco y dióxido de carbono. El carbamato producido es posteriormente degradado por hidrólisis espontánea para producir otra molécula de amoniaco y ácido carbónico y como efecto neto de estas reacciones se provoca un incremento del pH del medio.

Hidrólisis de la urea por la enzima ureasa produciendo 2 moléculas de amoniaco y una de ácido carbónico (Konieczna I et al. Curr Protein Pept Sci. 2012; 13: 789-806)

           La estructura de la ureasa fue desvelada por Jabri et al en 1995 en la bacteria Klebsiella aerogenes. Las ureasas bacterianas están compuestas normalmente por tres subunidades distintas, una grande α y dos pequeñas β y γ que forman tres trímeros con una estructura simétrica de dos pliegos. Las ureasas de las plantas y hongos, por el contrario, se componen de subunidades idénticas, comúnmente ensambladas como trímeros y hexámeros. El sitio activo de todas las ureasas conocidas se localiza en las subunidades α que contiene un centro de dos átomos de níquel separados con una distancia de unos 3.5 Å. Las moléculas de agua se localizan hacia la apertura del sitio activo y forman un clúster tetraédrico que llena la cavidad a través de enlaces de hidrógeno, aquí es donde la urea se une al sitio activo para la reacción, desplazando a las moléculas de agua. Los residuos de aminoácidos participan en la unión del sustrato, principalmente mediante enlaces de hidrógeno, estabilizando el estado de transición y acelerando la reacción.

Estructura de la ureasa. (A) Ureasas bacterianas con tres subunidades (modelo Klebsiella aerogenes). (B) Ureasa de plantas y hongos con una sola subunidad (modelo judía jack) (Aguirre L et al. Ciencia en la Frontera: Revista de Ciencia y Tecnología de la UACJ. 2016, Volumen Especial, 19-36)

Estructura en 3D de la ureasa de la bacteria Klebsiella aerogenes conteniendo dos iones de Niquel (esferas verdes)

               Una estrategia para controlar la actividad de la ureasa para aplicaciones médicas y agrícolas es usar inhibidores enzimáticos. La ureasa puede ser inhibida por metales pesados como resultado de la reacción con grupos sulfhidrilo en el sitio activo de la enzima. Por tanto, los metales que forman los sulfuros más insolubles son los inhibidores más fuertes de la ureasa. Los compuestos orgánicos análogos de la urea también pueden inhibir a la ureasa como las ureas alquiladas, tioureas, hidroxiurea e hidroxámicos.

           La ureasa es producida por una amplia variedad de bacterias, hongos, plantas e incluso algunos invertebrados. La urea es un producto del catabolismo de las proteínas en los animales y precisamente fue en 1828 el primer compuesto orgánico sintetizado debido a Friederich Wöller. La orina humana contiene un 2% de urea. La ureasa tiene efectos biológicos en los humanos, animales, plantas y en el suelo. Estos efectos son fundamentalmente beneficiosos debido a que el reciclaje de la urea suministra a estos organismos el nitrógeno que es tan necesario para sus funciones vitales y para su crecimiento.

               - Efectos de la ureasa en las plantas

            En las plantas, la ureasa se encuentra ampliamente distribuida en semillas y hojas de leguminosas participando en el reciclaje del nitrógeno a partir de la urea y posiblemente también en el transporte del nitrógeno con un papel destacado en la germinación de las semillas. El amoniaco resultante de la reacción puede proteger a la planta contra agentes tóxicos y parece ser que la enzima en sí misma actúa como un insecticida.

- Efectos de la ureasa en el suelo

      Muchos animales excretan urea con la orina. Determinados microorganismos productores de ureasa existentes en el suelo, como la Sporosarcina pasteurii, hidrolizan esta urea produciendo amoniaco que es fácilmente accesible a las plantas para obtener nitrógeno que es crucial para su crecimiento, lo que explica el amplio uso de la urea en agricultura como fertilizante nitrogenado. Sin embargo, un exceso de población de microorganismos ureolíticos en el suelo puede ser nocivo para las plantas por el efecto tóxico del amonio y la marcada alcalinización del suelo.

- Efectos de la ureasa en los humanos y animales

           Se han reconocido una serie de efectos beneficiosos de la ureasa bacteriana en los humanos y animales. Los rumiantes para facilitar la digestión de su dieta vegetal tienen bacterias ureolíticas en su cámara gástrica para producción de nitrógeno a partir de la urea producida por estos animales y que excretan en el rumen. En los humanos la actividad ureolítica de la microbiota intestinal hidroliza cerca del 15-30% de la urea sintetizada en el organismo ya que el amonio es la fuente de origen de nitrógeno preferido por las enterobacterias. Además, bacterias ureolíticas de la boca juegan un importante papel en la salud dental por su acción contra la formación de caries al contrarrestar la acidificación del biofilm dental. En el lado negativo, la ureasa puede actuar como un factor virulento provocando la formación de cálculos urinarios, úlceras pépticas y otras enfermedades. Estos microorganismos patógenos productores de ureasa se encuentran en el tracto urinario y gastrointestinal. La ureasa , por tanto, permite a las bacterias sobrevivir en los ambientes ácidos que frecuentemente colonizan. Una característica esencial de estas bacterias es su capacidad de persistir a largo plazo en las células huéspedes. Se puede detectar la actividad ureolítica mediante la aplicación de test diagnósticos.

Efectos biológicos en humanos de las bacterias productoras de ureasa (Mora D, Arioli S. PLoS Pathog. 2014; 10(12):1-4)

Ureasa como factor virulento en humanos

               Los microorganismos productores de ureasa están involucrados en la patogénesis de una serie de enfermedades como la infección urinaria, litiasis urinaria, gastritis, úlcera péptica, cáncer gástrico, colitis hemorrágica, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, aterosclerosis, tuberculosis y neumonías fúngicas.

                           - Litiasis urinaria

               La infección urinaria por gérmenes ureolíticos induce la formación de cálculos de fosfato amónico magnésico, carbonato apatita y urato amónico, y son la consecuencia de la formación de amonio y una elevada alcalinización de la orina por acción de la ureasa bacteriana. En la actualidad este tipo de cálculos suponen del 5 al 15% de todos los cálculos existentes en humanos. Los microorganismos ureolíticos más frecuentemente observados son especies de Proteus, Klebsiella, Pseudomonas y Staphylococcus.

(A) Proteus mirabilis. Bacteria ureolítica más frecuentemente observada en la formación de cálculos urinarios (SEM x29,000). (B) Cálculo renal coraliforme compuesto de fosfato amónico magnésico que se forma en presencia de infecciones urinarias por gérmenes productores de ureasa

Diagrama de los estadíos en la formación de cálculos por infecciones urinarias por gérmenes ureolíticos (Thomas B, Tolley D.. Nat Clin Pract Urol. 2008; 5(12):668-75)

                      - Úlcera péptica

                La ureasa juega un papel central en la patogénesis de la infección por Helicobacter pylori ya que el amoniaco generado en la hidrólisis de la urea tiene un efecto neutralizante de la acidez gástrica proporcionándole protección contra el bajo pH en el estómago. El H. pylori expresa una gran cantidad de ureasa que no se observan en otras bacterias y los niveles pueden alcanzar hasta el 10% de la proteína celular total. La ureasa del H. pylori es particular ya que combina cuatro de las enzimas regulares de seis subunidades en un conjunto tetraédrico general de 24 subunidades (α12β12) y se cree que este ensamblaje supramolecular confiere estabilidad adicional a la enzima en este microorganismo. La ureasa contiene 12 átomos de níquel por molécula y, por lo tanto, el H. pylori tiene una demanda relativamente alta de níquel.

                   - Otras enfermedades

               La ureasa bacteriana puede actuar como un antígeno que estimula al sistema inmune. Se ha encontrado relación entre los anticuerpos generados por infecciones crónicas de H. pylori y la patogénesis de la arteriosclerosis. También se ha establecido una relación entre la artritis reumatoide y la espondilitis anquilopoyética, enfermedades de base inmunológica, e infecciones por Proteus mirabilis al haberse observado en estos pacientes altos niveles de anticuerpos contra la ureasa de la bacteria. También se han detectado anticuerpos para las ureasas bacterianas de la Yersinia enterocolítica, Haemophilus influenzae y Brucella.

               La actividad ureolítica también es esencial para la supervivencia del Mycobacterium tuberculosis, la bacteria causante de la tuberculosis. Esta bacteria infecta a los macrófagos alterando la maduración de los fagosomas por la alcalinización provocada por la ureasa y, además, le permite la obtención de nitrógeno cuando la única fuente es la urea.

               Más recientemente, se ha observado un rol virulento de la ureasa en infecciones pulmonares por los hongos Cryptococcus neoformans y Coccidioides posadasii, en donde se genera amonio por hidrólisis de la urea presente en el líquido del revestimiento epitelial provocando una inhibición de la función inmune y contribuyendo al daño del tejido pulmonar.

Bibliografía recomendada

-Becker-Ritt AB, Martinelli AHS, Mitidieri S, Feder V, Wassermann GE, Santi L et al. Antifungal activity of plant and bacterial ureases. Toxicon. 2007; 50:971–83.

-Jabri E, Carr MB, Hausinger RP, Karplus PA. The crystal structure of urease from Klebsiella aerogenes. Science. 1995; 268(5213):998-1004.

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-Konieczna I, Zarnowiec P, Kwinkowski M, Kolesinska B, Fraczyk J, Kaminski Z et al. Bacterial urease and its role in long-lasting human diseases. Curr. Protein. Pept. Sci. 2012; 13:789-806.

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-Sumner JB. The isolation and crystallization of the enzyme urease: Preliminary paper. J. Biol. Chem. 1926; 69:435-41.

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-Sumner JB. The chemical nature of enzymes. Nobel lecture, December 12, 1946. In Nobel Lectures: Chemistry. New York: Elsevier, 1946.

-Zimmer M. Molecular mechanics evaluation of the proposed mechanisms for the degradation of urea by urease. J. Biomol. Struct. Dyn. 2000; 17(5):787-97.

Cómo citar este artículo:
Lancina Martín JA. James Batcheller Sumner (1887-1955) premio Nobel de Química por aislar y cristalizar por primera vez una enzima, la ureasa, demostrando además la naturaleza proteica de las enzimas [Internet]. Doctor Alberto Lancina Martín. Urología e Historia de la Medicina. 2020 [citado el]. Disponible en: http://drlancina.blogspot.com/2020/05/james-batcheller-sumner-1887-1955.html